一、RNA模板的制备

RNA模板的准备是生物医学研究中的一个重要环节，常见的RNA提取方法有传统的酚CHCl₃抽提法和柱式抽提法。

1. 酚CHCl₃抽提法

以ag尊龙凯时的产品RNAisolater Total RNA Extraction Reagent（Vazyme#R401）为例，操作流程如下：

自备材料：CHCl₃、异丙醇、75%乙醇（使用DEPC水配置）、DEPC水。

样本制备：过多的样本量可能导致样本裂解不充分并降低产物纯度。每1ml RNAisolater能够充分裂解的最大样本量如下：

贴壁细胞：首先弃去培养液，用PBS洗涤一次。对于贴壁牢固的细胞，可以用细胞刮勺剥离。接下来，每10cm²的培养面积加入1-3ml RNAisolater，确保其充分覆盖细胞表面，然后用移液器将细胞吹打下来。

裂解后，将裂解液转移至15ml离心管中，用移液器反复吹打直至无明显颗粒，并在冰上静置5分钟。

悬浮细胞：离心收集细胞并用PBS洗涤一次。每5×10⁶到10⁷个细胞需加入1ml RNAisolater。用移液器反复吹打，确保无明显颗粒，冰上静置5分钟。

动物组织的处理：研磨动物组织时需使用液氮。（不彻底的研磨会影响RNA的得率和质量）:

将液氮研磨后的粉末立即转移至离心管中，加入RNAisolater裂解液，待样品完全融化后继续吹打至裂解液透明。随后将裂解液转移至离心管中，12,000×g、4℃离心5分钟，吸取上清。

匀浆处理：新鲜组织尽量剪碎并浸泡在RNAisolater裂解液中，用电动匀浆器高速匀浆，确保组织完全研磨均匀。然后转移裂解液至离心管中，进行12,000×g、4℃离心5分钟，并吸取上清。

2. 柱式抽提法

以ag尊龙凯时的FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation MiniKit（Vazyme#RC101/RC111）为例，准备如下材料：

自备材料：β-巯基乙醇、无水乙醇、RNase-free枪头等。

细胞培养：贴壁细胞无需消化，可直接使用Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇）进行裂解；或用胰酶消化后离心收集细胞，加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1，并用移液器反复吹打混匀直到看不到细胞团块。注意，在Buffer RL1中需预先添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。

悬浮细胞：直接离心收集细胞，加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞添加500μl Buffer RL1，用移液器反复吹打混匀，确保细胞完全裂解。如不立即进行后续操作，可以将样本保存于-70℃。

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